Del, , Google Plus, Pinterest,

Print

Posted in:

Genetisk intratumor heterogenitet i brystkreft

At brysttumorar kan være heterogene er langt i frå noko ny-oppdaga fenomen.  Ved enkel immunhistokjemi og mikroskopering har ein sett at svært mange protein er ulikt uttrykt i ulike celler, og i ulike områder av tumorar. Tilsvarande heterogenitet er òg lett synlig i mikroskopet dersom ein ser på DNA-kopitallsnivå ved hjelp av til dømes. FISH / CISH mot enkeltgen.

Bakgrunn

Mtp på det store fokuset som ein pr. i dag har på molekylært målretta medikament innan kreftforsking og kreftbehandling, er det openbart at biopsiar som er representative for dei mutasjonar som fins i ein tumor, er heilt essensielt for å kunne identifisere mutasjonane og deretter gi pasienten korrekt målretta behandling. I så måte er intratumor heterogenitet eit potensielt problem, ettersom ein biopsi frå ein subklon i tumoren, i teorien, kan inneholde heilt andre mutasjonar enn den subklonen som er mest aggressiv / har metastatisk potensiale.

Dei teknologiske nyvinningane som har komt dei siste åra (særlig massiv parallell sekvensering – «next generation sequencing»), har imidlertid gjort det mulig å studere intratumor heterogenitet i langt større detalj enn tidligare, noko som gjev oss unike innblikk i enkelttumorar si sub-klonale samansetting og klonale evolusjon.

I løpet av dei siste åra, har det vore publisert fleire studiar der problematikken rundt genetisk intratumor heterogenitet er forsøkt adressert. I praksis har dette vore gjort ved at ein, etter sekvensering, «sorterer» mutasjonar i ein tumorprøve etter kor stor andel av tumorcellene som er ramma av mutasjonen. Dersom ein til dømes ser ein mutasjon i 80% av tumorcellene og ein annan mutasjon i 50% av tumorcellene, kan ein anta at den siste mutasjonen er tilstades i celler som er ein subklon av cellene med den første mutasjonen. Tilsvarande berekningar basert på full exom / genom sekvensering, der ein kan inkludere mange hundre / mange tusen mutasjonar i reknestykka, gjer at ein kan gi relativt gode estimat for subklonalitet og heterogentiet i tumorprøver. Slike studier har til dømes vist at det, kan være relativt stor grad av genetisk intratumor heterogenitet i brysttumorar (Nik-Zainal et al., 2012a; Nik-Zainal et al., 2012b).

Felles for desse, og andre tilsvarande studier, er imidlertid at dei er begrensa til å berre undersøke ein enkelt biopsi frå eit gitt område av tumoren. Dermed kan ein gå glipp av viktige subklonar i andre delar av tumoren, og risikere å undervurdere graden av intratumor heterogenitet i pasienten.

Figur_1_8biopsar
Figur 1.

Intratumor heterogenitet ved primær brystkreft

Nylig har vi ved Mohn Kreftforskninglaboratorium, i samarbeid med Kirurgisk avdeling og Avdeling for patologi ved Haukeland universitetssjukehus, designa og bidrege til ei større studie, der målsettinga var å skaffe ein langt meir detaljert oversikt over graden av genetisk heterogenitet / subklonalitet i brystkreft (Yates et al., 2015).

I denne studien bestod hovudmaterialet av prospektivt innsamla biopsiar frå 12 pasientar. Dette var pasientar med behandlingsnaive brysttumorar, operert ved Haukeland universitetssjukehus. Frå kvar pasient vart 8 biopsiar tatt frå primærtumor, i følgje eit strikt pre-definert kart (Figur 1). I tillegg til å identifisere subklonalitet og heterogenitet slik det har vore gjort tidligare (som skildra over), gjorde denne studie-designen det mulig for oss å legge på eit ekstra lag med informasjon om dei ulike geografiske områdene i kvar tumor, og dermed få eit unikt og langt meir detaljert bilde av subklonalitet og heterogenitet i kvar av dei undersøkte tumorane.

DNA frå kvar biopsi vart sekvensert ved massiv parallell sekvensering av 360 gen. Dette var gen som på førehand var nøye plukka ut, basert på at dei er meir hyppig muterte i kreft enn det ein statistisk skulle forvente ved ein tilfeldig fordeling av mutasjonar utover det humane kreftgenomet. Med andre ord gen som med stor sannsynlighet kan inneholde såkalte «driver»-mutasjonar, det vil si mutasjonar som gir kreftceller overlevelsesfordelar og dermed bidrar til klonal ekpansjon av maligne celler.

Funna frå denne studien viser at dei undersøkte tumorane, grovt sett, kan delast inn i tre ulike kategoriar (Figur 2):

  1. Nokre tumorar er i all hovudsak homogene. Dette er tumorar der vi fann dei same mutasjonane i alle prøver som er tatt frå pasienten, og der mutasjonane i stor grad er tilstade i same fraksjon av analyserte DNA-molekyl. Mykje tyder imidlertid på at dette berre gjeld eit mindretal av brysttumorar: Av dei tolv mest detaljert analyserte pasientane i vår studie fann vi berre ein med dette mutasjonsmønsteret.
  2. Nokre tumorar er heterogene, men med klart geografisk adskilte subklonar. I slike tumorar fann vi  eit subsett av mutasjonar som var tilstade i alle prøvene, og som såleis representerer siste / eldste felles klon for kreftcellene. I tillegg fann vi mutasjonar som var tilstade i berre nokre av prøvene, men der dei prøvene som inneheldt dei same mutasjonane var geografiske nabo-prøver.
  3. Nokre tumorar er heterogene med stor grad av infiltrerande vekst mellom dei ulike subklonane. I slike tumorar fann vi  (som i punkt 2, over) nokre mutasjonar som var tilstade i alle prøvene, og som representerer siste felles klon for kreftcellene. Dei mutasjonane vi elles detekterte var tilstade i biopsiar som ikkje hadde noko særskilt forhold seg imellom mhp. geografisk lokalisering. Dette tyder på at desse tumorane er samansette av ulike subklonar som har eit meir intrikat vekstmønster der dei vekst infiltrerande i kvarandre.

Figur_2_Biopsi
Figur 2.

Tilfeldige tidspunkt for «driver»-mutasjonar

Basert på informasjonen vi kunne ekstrahere frå datasettet, berekna vi òg «fylogenetiske trer» for utviklinga av dei ulike subklonane i dei analyserte tumorane. Dette er mulig, basert på dei same, relativt enkle prinsipp som nemnt over, der ei antar at mutasjonar som er felles for alle biopsiar i ein pasient, representerer siste felles klon, medan mutasjonar som er tilstade berre i nokre av biopsiane representerer subklonar som har utvikla seg i ettertid. (Vidare kan ein identifisere subklonar av subklonar og så bortetter.). I motsetning til andre kreftformer der liknande studier har vist at enkelte viktige «driver»-mutasjonar alltid er tidlige hendingar i tumorgenesen (til dømes VHL mutasjonar i renalcancer (Gerlinger et al., 2012)), fann vi ingen faste tidsmessige mønster for mutasjonar i brystkreft: I dei analyserte pasientane fann vi at viktige og velkjente «driver»-mutasjonar for brystkreftutvikling (til dømes TP53, PIK3CA, PTEN, BRCA2 og CDKN2A) oppstod tidlig i nokre pasientar, men seint i andre pasientar. Med andre ord tyder desse funna på at brystkreftutviklinga er meir kompleks, og mindre fastlåst til spesifikke mutasjonsrekkefølgjer enn enkelte andre tumorformer (som til dømes coloncancer og renalcancer).

 

Intratumor heterogenitet medfører praktiske problem med tanke på. kor representativ ein biopsi er for ein heil tumor. Enkelte miljø hevdar at problemet kan løysast ved å la være å ta biopsi av tumoren i det heile, men heller sekvensere fritt tumor DNA som kan isolerast frå plasma. Tanken her, er at døde tumorceller frigjer DNA, og at den tumor-DNA’en ein kan identifisere frå plasma vil være representativ for heile tumormassen. Nyare studiar som har prøvd ut denne strategien viser imidlertid at det er ein sterk korrelasjon mellom tumorbyrde og i kor stor grad fritt tumor-DNA i plasma er representativt for heile tumoren (Bidard et al., 2013). Ved mindre tumorar virkar plasmaprøver å være lite representative for mutasjonar som er tilstade i tumoren. Det er mulig at dette er eit problem som vil vedvare rett og slett fordi ikkje alle tumorceller bidrar til den totale «poolen» av fritt tumor-DNA, men det kan òg tenkast at dette er eit reint teknisk problem, og at ein vil være i stand til å detektere DNA frå alle / dei fleste subklonar i ein tumor, i plasma, ved å sekvensere med større dybde. Dette vil i praksis, sjølvsagt verte eit spørsmål om økonomi, og kor mulig / billig det vert å rutinemessig sekvensere plasmaprøver med virkelig høg dybde i tida som kjem.

Referanser

  1. Bidard, F.C., Weigelt, B., and Reis-Filho, J.S. (2013). Going with the flow: from circulating tumor cells to DNA. Science translational medicine 5, 207ps214.
  2. Gerlinger, M., Rowan, A.J., Horswell, S., Larkin, J., Endesfelder, D., Gronroos, E., Martinez, P., Matthews, N., Stewart, A., Tarpey, P., et al. (2012). Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. The New England journal of medicine 366, 883-892.
  3. Nik-Zainal, S., Alexandrov, L.B., Wedge, D.C., Van Loo, P., Greenman, C.D., Raine, K., Jones, D., Hinton, J., Marshall, J., Stebbings, L.A., et al. (2012a). Mutational processes molding the genomes of 21 breast cancers. Cell 149, 979-993.
  4. Nik-Zainal, S., Van Loo, P., Wedge, D.C., Alexandrov, L.B., Greenman, C.D., Lau, K.W., Raine, K., Jones, D., Marshall, J., Ramakrishna, M., et al. (2012b). The life history of 21 breast cancers. Cell 149, 994-1007.
  5. Yates, L.R., Gerstung, M., Knappskog, S., Desmedt, C., Gundem, G., Van Loo, P., Aas, T., Alexandrov, L.B., Larsimont, D., Davies, H., et al. (2015). Subclonal diversification of primary breast cancer revealed by multiregion sequencing. Nature medicine 21, 751-759.